WIWAM植物表型成像系统由比利时SMO公司与Ghent大学VIB研究所研制生产，整合了LED植物智能培养、自动 化控制系统、叶绿素荧光成像测量分析、植物热成像分析、植物近红外成像分析、植物高光谱分析、植物多光谱分 析、植物CT断层扫描分析、自动条码识别管理、RGB真彩3D成像等多项先进技术，以较优化的方式实现大量植物样 品——从拟南芥、玉米到各种其它植物的生理生态与形态结构成像分析，用于高通量植物表型成像分析测量、植 物胁迫响应成像分析测量、植物生长分析测量、生态毒理学研究、性状识别及植物生理生态分析研究等。

室内植物表型成像系统WIWAM Line

不同生长条件下拟南芥GRF3类转录因子促进叶片的显著增长

作物产量的增加对于确保粮食安全以满足不断增长的全球需求至关重要。一些基因修饰可以增加器官的大小，从而提高作物产量。尽管如此，只有在少数情况下，在胁迫条件下对其性能进行了评估。MicroRNA miR396抑制生长调节因子（GRF）基因的表达，GRF基因编码促进器官生长的转录因子。本文表面拟南芥At-GRF2和At-GRF3抗miR396活性基因（rGRF2和rGRF3）都增加了器官大小，但只有rGRF3可以产生这种效应而不会造成形态学缺陷。此外在甘蓝中引入At-rGRF3可以增加器官的大小，而在拟南芥中引入大豆和水稻的At-rGRF3同源物也会增加叶片的大小。这表明miR396对GRF3活性的调节对于许多物种的器官生长是重要的。在干旱胁迫下，含有rGRF3的植物也有较大的叶片，这一条件刺激了miR396的积累。这些植物还表现出对毒力细菌的抗性增强，这表明rGRF3促进的大小增加在植物防御上没有明显的成本。我们的研究结果表明，rGRF3可以在正常和胁迫条件下增加植物器官的大小，是一种有价值的生物技术应用工具。

图1.miRNA miR 396对GFR转录因子的广泛控制

在拟南芥中有九个GRF（图1a，b），其中七个GRF的miR396靶位位于编码WRC结构域羧基端的区域（图1b，c）。miRNA靶点在不同的GRF中是相同的，但位置8处除外，其中GRF 1-4中有一个C，GRF 7-8中有一个a，GRF9中有一个U（图1c）。该可变碱基相对于miRNA位于凸起位置，因此对于所有转录因子而言，与miRNA的相互作用非常相似，然而，WRC结构域羧基端的编码氨基酸序列不同（图1c）。有趣的是，拟南芥GRF基因结构显示外显子-内含子组织和定义该家族的蛋白质结构域分布的差异（图1b）。我们分析了不同被子植物GRF中miRNA靶点的出现情况（图1d）。在许多物种中，如毛果杨、大豆和截形苜蓿，所有GRF都有一个miR396结合位点（图1d），而在其他物种中，如拟南芥和水稻，一些基因缺少该序列。有趣的是，在拟南芥GRF5中有一个与miRNA靶点非常相似的序列，这是该物种中缺少miR396调控的两个GRF之一（图1c）。这些发现表明miR396广泛分布GRF调节，并提示这可能是这些转录因子在被子植物中的默认状态。

图2.与rGRF2相比，rGRF3 在增加叶片尺寸方面的能力更强

分析了大约30株含有rGRF2 或 rGRF3的初级转基因植物（图2a，b），它们从它们自己的启动子中表达出来。尽管两种构建体都能够增加叶面积，但由 rGRF3引起的效果显着高于使用 rGRF2 获得的效果。然后我们选择了rGRF2和rGRF3 纯合T3转基因系并确定了GRF 转录水平（图2d）。我们发现GRF3表达增加2倍足以改变70%的叶面积，而GRF2 转录本增加25倍以上需要引起器官大小的类似增加（图 2d，e）. 在这两种情况下，器官大小的增加是由于细胞数量的类似增加，细胞大小没有明显变化（图2e、f 和 g）。

对rGRF2植物的进一步分析表明，叶片具有形态缺陷，包括长而扭曲的叶柄，叶片向下卷曲（图2c）。另一方面，rGRF3植株除了叶面积增加外没有观察到明显的形态变化。我们认为增加叶片尺寸所需的高水平GRF2也会导致植物发育中的额外形态缺陷。 为了确认启动子不是rGRF2和rGRF3之间观察到的差异的原因，我们从GRF3启动子中表达了rGRF2 和 rGRF3，并观察到pGRF3:rGRF3比pGRF3:rGRF2引起更大的叶面积增加（图 2h）. 因此，表达水平和GRF蛋白序列都应被视为有效增强植物器官大小。如图所示，虽然两种rGRF均可用于增加器官大小，但rGRF3是植物器官大小的更活跃和特异性增强剂。

图3.rGRF3样基因增加异源物种的器官大小

本文分析了来自rice6和soybean8的GRF转录因子序列数据库，并选择了与At-GRF3最相似的数据库。然后，我们在拟南芥At-GRF3启动子下表达了大豆和水稻拟南芥GRF3样编码序列。由于这两个基因都有一个miR396靶点，我们引入了同义突变以避免被小RNA识别。我们观察到由大豆和水稻rGRF3样转录因子引起的叶片大小增加（图3a，b）。为了评估rGRF3对其他物种叶片大小的影响，我们在甘蓝型油菜转基因植物中表达了转录因子（图3e）。对两个独立转基因系的分析显示，叶面积显著增加20%和32%（图3c，d）。对转基因叶片的进一步表征表明，叶片大小的增加是由更多的细胞引起的，而不是由细胞大小的影响引起的（图3c）。对甘蓝rGRF3#10植物根系生长的评估表明，这些植物的初生根比对照植物的伸长率更高（图3h，i）。此外，这些植物的种子大小也增加了10%（图3f，g）。综上所述，这些结果表明，当与miR396调控脱钩时，来自不同物种的AtGRF3样序列有力地增加了几个器官的大小，包括叶、根和种子。

图4.miR396-GRF系统对干旱胁迫的响应

干旱胁迫是一种相当复杂的情况，根据胁迫的大小和植物的发育阶段会触发不同的反应途径。特别是，水限制条件抑制发育中器官的细胞增殖和扩张和/或在成熟器官中诱导一系列复杂的耐受和存活反应。在田间条件下，有限的水供应通常会降低植物生长、生物量积累，从而降低种子产量。使用自动表型分析平台 WIWAM评估了植物对适度干旱胁迫的反应，包括土壤含水量减少。在这些条件下，用空载体转化的对照植物的莲座面积减少了40%（图 4a），叶1面积减少了35%（图4f）。

使用转录报告基因 MIR396B:GUS 观察了 MIR396B 的表达，这使我们能够监测叶子中最丰富的 miR396 编码基因的表达。播种后第 11 天 (DAS) 在浇水良好的盆中 MIR396B 在叶片 3 的近端以低水平表达，即仍处于增殖状态（图4b）。 MIR396B:GUS 的最高表达出现在叶的远端区域，在该区域中细胞退出细胞周期。当植物受到轻度干旱胁迫时，叶片尺寸减小，并且在更大的远端叶区域中检测到 MIR396B:GUS 表达，并且染色更强烈（图4b、c）。因此，小RNA 印迹显示，受胁迫植物的发育叶片中成熟 miR396 水平增加了 70%（图4d）。相比之下，At-GRF3 转录水平降低了约 60%（图4e）。总之，这些结果表明 miR396 网络响应干旱胁迫。然后我们评估了miR396-GRF3 调控nde在干旱胁迫期间的作用。为此我们首先分析了35S:miR396 植物对轻度干旱胁迫的反应，由于miRNA 的过度表达和 GRFs12 的抑制，这些植物的叶子很小（图4f）。当对这些植物施加干旱胁迫时，未观察到器官大小的进一步减小（图4f），表明转基因 miR396 过表达掩盖了源自内源性诱导的MIR396B的影响。

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