Videometer多光谱成像系统-植物病理表型组学-植物病害光谱指纹

利用Videometer多光谱成像技术研究小麦根部病害

小麦是全世界最重要的作物之一，对全球食品安全至关重要。“Take-all ”根病害是由子囊菌真菌Gaeumannomyces tritici(Gt)致病，可穿透根并毁坏维管系统。形成的黑色坏死斑破坏了养分和水吸收，导致减产达60%。其它密切相关子囊菌真菌品种，例如G. hyphopodioides(Gh),却是对抗“take-all”病的生物控制剂。

G.hyphopodioides可侵染外皮质根层，但与“Take-all”不同，其不会侵入到中间部位，特征是在菌表面和亚皮下囊泡形成灰色菌丝。

来自英国的科学家研究重点是对高级成像技术进行评估，以对根定植进行真菌检测和精确定量，通过测量光合参数评估对地上部健康的影响。研究中使用了VideometerLab 多光谱成像系统。

图中显示“Take-all”感染小麦幼苗。左侧是原始图像，有红色箭头标示“take-all ”损失，用手工评分；右图是相同图像经‘VideometerLab’分析，将根组织分类为感病(蓝色)和健康(桔色/黄色)。

利用Videometer多光谱成像系统对藜麦霜霉病成像

藜麦(Chenopodium quinoa)是一种作物，营养丰富，在多个国家广有种植。真菌病如霜霉病限制了谷物产量，培育抗性品系，如抗霜霉病品系是藜麦育种的中心目标。

利用常规RGB成像来测量藜麦对霜霉病的表型反应(Peronospora variabilis ) 测量比较困难，原因在于来自不同藜麦基因型在叶片上有不同绿色和红色斑点进行干扰，参见图1和图2。 

开发图像分析规程来区分健康藜麦叶片组织以及感染霜霉病的藜麦叶片组织。研究利用Videometer多光谱成像系统对严重度程度表型和孢子形成进行研究。

严重程度是叶片正面损伤的面积占整个叶片面积的百分比。依基因型不同，颜色可为桔色、黄色或红色。

孢子形成是损伤部上方孢子量，以百分比测量，通过测量叶片正面进行评估。 

图1 叶片正面严重度症状

图2 叶片正面孢子形成

多光谱图像分析

研究人员利用VideometerLab 4多光谱成像系统进行多光谱成像，积分球确保对样品的均一照明(图3)。每个获取的图像层由19个不同图像波段组成，波长涵盖365nm（UVA）到970nm（NIR）。图像的每个像素分辨率为~41 µm。每个图像层的分辨率为2192X2192像素。

图像分析严重度模型

从G9基因型叶片正面(图4)清楚看到了黄化现象(A)，拍摄了RGB图像（常规相机，人眼可见光波段。(B)和(C)显示了多光谱图层中的2个波段，蓝光490nm(B)和黄光570nm(C)。对健康植物组织和黄化界定进行了初始标记，首次转换建立了模型(D)，通过nCDA（归一化典型判别分析将19个波段信息（图像中多个图层），转换为了整个图层的代表像素范围值。之后切割(E和F)，可用于所有图像-所有品系和基因型，获取有黄化组织（E黄色）百分比定量分析，该特定叶片比例为68.0%，或者包括红色覆盖孢子区(F)，比例为18,9%，黄化（黄色）比例68%，孢子和黄化区综合面积占比75.8%。 

图像分析孢子形成

在叶片正面（底部），RGB图像中的G9基因型清晰可见到孢子形成图像（下底部A和B放大）。尽管在可见光波段很难检测到单个波段，这里特别标出了蓝光波段（490nm）（C）。进入NIR（780nm）波段（下左部的D和E放大），清晰看见了孢子。使用该信息（仅标识黑灰色孢子）可帮助我们区分切割孢子像素（F），并将该面积定量，该叶片孢子比例为12.5% （黄色显示），不包括黄化部分面积。

另外，此处的孢子标识与正面图像分析而言更加保守。 覆盖的非黑灰区的像素部分 (像素比单个孢子要大）估计，孢子比例为~23%（此处未予以显示)。

图4(A) sRGB图像。(B)，490nm(蓝光)，(C)，570nm(黄色)，(D) 转换，(E)和(F)，2种类型定量分割。

图5(A) sRGB 图像，(B)490nm(蓝光)，(C) 570nm(黄色)，(D)转换，(E)定量分割。

结果

图6:133个基因型的平均严重程度（%）分布

表1手工以及基于多光谱表型成像的藜麦霜霉病互作

研究对相关的132个藜麦基因型对霜霉病的表型反应进行了研究。设置了3个实验，每个有4个区块，配有复制控制样品以及非复制基因型样品。找到了对P. variablilis 反应变异大的藜麦基因型，发现了基因型对互作有着显著影响 (p-value = 1.18 x 10-18) 图6。研究人员对图像表型研究结果进行了比较，研究人员正在开发适合覆盖整个反应的算法。该综述中，研究者展示了与G9基因型相对应的叶片图像。结果总结在表1中，来不同区块和试验的分属不同植株的10片叶子取了平均值。

结论

多光谱成像如严格按照规程使用、记录完善的话，是非常强劲的表型工具。对图像定量基于算法应用，这需融合对疾病反应的经验和知识。对孢子形成，菌丝萌发，渗透，侵染面积以及健康组织识别可提供更加近似的像素标识。

目前研究人员已经开发出了可应用于藜麦霜霉病互作的应用于损伤组织算法。 

利用Videometer多光谱成像系统研究镰刀菌抗性 

科学家开发了一种多光谱成像算法来评估小麦对镰刀菌(F. graminearum and F. culmorum)的抗性。获取结果与VDA方法视觉疾病评估）和qPCR方法进行了比较。研究目标是选择新型、快速的表型方法来替换现有评价的VDA抗性评估方法。

视觉疾病评估方法与Videometer在不同生理阶段对麦穗和群体的相关性(360-1050nm)

比RGB成像区分效果要好

传送带上获取图像

VideometerLab® 以及传送带

2056x2056 像素/波段

1000粒种子扫描仅需5-10 min

镰刀菌感染区域鉴别

感染镰刀菌小麦粒                CDA图像

基于典型判别分析（CDA）分析感染麦粒(黄/红），未感染 (蓝色) 

镰刀菌损害麦粒定量(FDK)

-分类像素的阈值化

-Excel 结果输出

材料和方法

实验设计:

- 喷洒接种：F.graminearum & F.  culmorum

- 冬小麦： 5栽培种  (抗性控制)

- 25 麦穗（2个重复）(使用 VDA和 Videometer)

田间视觉评分：  

360°C dpi : % 结痂小穗 ; % FDK

成熟 : % FDK

Videometer : % FDK

培养皿

-单穗：第1次重复25穗/cv

-散装：≈从第2个重复的25个穗中收集1000粒/cv

传送带

‒散装≈从第二次重复的25个穗中收集1000粒/cv

qPCR

-5个品种≈第二次复制的1000粒/cv

-研磨每个品种的所有果仁，并从50 mg面粉中提取DNA

-具有特定TaqMan的qPCR® F.graminearum的探针

结果

在不同生理期的不同个体麦穗和群体

相关性总结

% 结痂麦穗s & % FDK

 单个麦穗 &群体

‒ Videometer: 培养皿 & 传送带

‒ 360°C dpi评分 & 成熟 

VDA （360°C麦穗和麦粒成熟) 与Videometer在麦粒成熟度上有很强相关性，以下模块：

‒单独麦穗& 群体

‒ Videometer带培养皿和传送带

在其它试验中，用F. graminearum接种，观察到了Microdochium spp自然侵染的微弱相关性。

2.qPCR, VideometerLab® 和VDA的疾病评估相关性。

在qPCR 于带传送带的Videometer 评估群体采集麦粒之间有高度相关性(R=0.91)，qPCR与 VDA 在 360°Cdpi也有高度相关性(R=0.95)，验证了VideometerLab® 在成熟阶段麦粒精确评估、快速定量镰刀菌的能力，这与抗性分类相一致。

结论与展望

使用VideometerLab®集合开发算法，在评价感染镰刀菌（Fusarium graminearum）和culmorum 的抗性时取得了很好的结果。更多时间将在更多品系小麦以及谷物上进行。针对该应用还可开发更多的算法。

利用Videometer多光谱成像系统发表的部分植物病理表型组学文章

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