一、实验目的
   乙烯是影响园艺产品成熟与衰老的重要气体成分之一，研究果蔬等园艺产品中乙烯合成速率对控制产品成熟与衰老具有重要意义。ACC是乙烯合成的直接前体物质，乙烯分析仪研究ACC合成及代谢能反应生物体内乙烯的合成情况。 

二、实验原理
   ACC是一种氨基酸，可按常规方法提取。制备得到氨基酸的粗提物，在冷却和Hg2+存在下，用NaOCl专一地使ACC转变成乙烯，所释放的乙烯用气相色谱仪分析，根据乙烯的产量计算出ACC的含量。

三、试剂
1. NaClO-NaOH混合液：用5%的NaClO和饱和的NaOH溶液（2:1; v/v）混合均匀后置冰上冷却备用，需当天配制。
2. 25mM的MgCL2溶液：称取67mg MgCl2溶于10 ml蒸馏水中，配制时可加热或加入一小滴2M的HCl使之溶解后定溶。
3. 0.1mM的ACC溶液：有效称取1.0mg的ACC放于10 ml容量瓶内用蒸馏水溶解并定容，置冰箱中保存备用。

四、实验方法
1. 样品制备：将2g供试样品加入10 ml浓度为95%的乙醇匀浆，于1000g条件下离心10min，倒出上清液，残渣再加入10 ml浓度为 80%的乙醇，于70℃浸提、离心2次，弃残渣，合并上清液， 在40℃下用薄膜旋转浓缩仪减压浓缩至干，加入1ml氯仿，在旋涡器上振动半分钟以溶解色素，然后加入2ml蒸馏水振动1分钟，混合液在4000g下离心5分钟或置冰箱中过夜，使水相与热氯仿分开，弃氯仿层， 吸取水相用来分析ACC含量。
2. ACC的测定： 分别取水解后的制备液250μl加入直径14mm长120 mm的试管中, 加入40μl浓度为125mM的HgCl2， 加入蒸馏水610μl，置试管于冰浴中预冷数分种，等温度平衡后用血清瓶塞密封试管，然后注入100μl冷却的NaClO-NaOH混合液,立即旋涡混匀5s，约2—3min后再振动一次，用注射器取1.0 ml气体测定乙烯释放量 。 反应中ACC转变为乙烯的效率可通过在反应液中加入一定量的标准ACC作为 “内标”来确定。根据乙烯释放量和转化效率可计算出ACC含量。水解前的样品所测得的ACC量为游离ACC，水解后所测得的ACC量系游离ACC与结合ACC之和，后者减去前者即为MACC的量。
3.乙烯分析仪测定：乙烯用气相色谱测定。 

五、注意事项：

1. ACC量与乙烯释放量之间的线性范围较其灵敏度：反应系统中ACC量在10-10—10-6范围内， 乙烯产生与ACC含量呈线性关系，线性范围与灵敏度取决于气相色谱仪的性能。
2. ACC转变为乙烯的效率： 用“内标”法测定， 通常待测样品中加入相当于样品中ACC量2—3倍的标准ACC，把测得的乙烯量减去样品中所释放的乙烯量即为标准ACC所释放的乙烯量，后者与所加入标准ACC释放乙烯的理论值的百分比即为转化率。
3. 水解液中pH值对转化率的影响：水解MACC时须加入浓HCl，测定时用NaOH溶液中和， 否则会影响转化率。
4. 反应温度对转化率的影响：在测定前和测定过程中，试剂、样品及试管均需在冰浴中预冷。

六、作业：
    结合课堂学习和本实验的内容，试分析苹果和柑橘在成熟与衰老过程中与ACC代谢有关的两种主要酶类的活性变化规律。